Nato a Springfield, Ohio, da Pam e John Chambers, Justin Chambers vanta una famiglia piuttosto numerosa. Ha un fratello gemello di nome Jason e altri due fratelli e una sorella più grandi di lui. Fin da piccoli, Justin e il suo gemello Jason sono costretti a costanti ricoveri in ospedale a causa di frequenti attacchi di polmonite, disturbi che si sono poi attenuati con la crescita. Anche nella vita privata, il nostro affascinante ed enigmatico dottore sembra preferire di gran lunga i nuclei familiari affollati, come dimostrano i suoi cinque figli, Isabella, le gemelle Maya e Kaila, Eva e Jackson, avuti dalla moglie Keisha, ex pezzo grosso di una rinomata agenzia di modelle, sposata nel 1993. Negli ultimi tempi, la famiglia Chambers si è trasferita a Los Angeles da un quartiere periferico fuori New York.

In occasione della sua partecipazione al Jimmy Kimmel Live, Justin ha dichiarato che le sue figlie hanno formato una band chiamata Nyla...! La carriera artistica di Chambers sembra sia iniziata quasi per caso. Scoperto da un talent scout alla continua ricerca di modelli da proporre per spot e campagne pubblicitarie, Justin viene improvvisamente scelto come nuovo volto (e corpo...) per rappresentare addirittura il rinomato marchio Calvin Klein, in una nota pubblicità  di profumi. Successivamente, lavora a lungo come modello in Europa, Giappone e negli Stati Uniti, legando la sua immagine a griffe prestigiose, da CK ad Armani, a Dolce & Gabbana. Deciso a intraprendere il mestiere di attore, Chambers abbandona la moda e si stabilisce a New York, dove studia recitazione agli H. B. Studios per ben quattro anni. Tanto impegno e dedizione lo portano presto a ottenere ruoli più che dignitosi in alcuni serial TV, tra cui Another World e New York Undercover. Recentemente, Justin è apparso anche in numerose produzioni cinematografiche degne di nota: Prima o poi mi sposo - The Wedding Planner nel 2001 a fianco della sensuale Jennifer Lopez, The Musketeer sempre nel 2001, Southern Bells e Zodiac nel 2005, e la celebre pellicola prodotta dal canale HBO, Hysterical Blindness del 2002. Tra i suoi più importanti successi televisivi, tre episodi della nota serie TV crime Cold Case e, naturalmente, il fortunato personaggio di Alex Karev interpretato in 7 stagioni di Grey's Anatomy. Da ricordare come il suo esordio da attore protagonista risalga al 1994, quando venne scelto per il videoclip Ants Marching dei Dave Matthews Band. Justin è sposato con Keisha Chambers dal 1993, e i due hanno ben 5 figli.